日機裝株式會社

日本勃林格殷格翰株式會社

金澤大學

日機裝株式(shi)會社、日本勃林(lin)格(ge)殷格(ge)翰株式(shi)會社與(yu)?澤?學醫(yi)藥(yao)保(bao)健研究域(yu)(yu)藥(yao)學系的(de)(de)?井 郁?教授等人的(de)(de)研究組，成功(gong)研發(fa)了具有正(zheng)常培(pei)養條件下無法觀(guan)察到的(de)(de)腎(shen)臟功(gong)能(neng)的(de)(de)創新(xin)藥(yao)物研究用人腎(shen)細胞(bao)『3D-RPTEC』。新(xin)開(kai)發(fa)的(de)(de)技術有望在創藥(yao)研究領域(yu)(yu)中代替過(guo)去主要通過(guo)動物實驗測試藥(yao)物的(de)(de)細胞(bao)實驗，并且(qie)為(wei)提(ti)高新(xin)藥(yao)開(kai)發(fa)的(de)(de)效率做出貢(gong)獻。

本研究結果(guo)已在2023年(nian)6?29?科(ke)學志『 Drug Metabolism and Disposition 』 （）刊登。

創藥研究用人腎細胞，是通過用特殊的培養方法培養市售的人腎由來細胞，再現了至今為止難以觀察到的腎臟功能，實際已經確認其具備約20種主要藥物轉運體^※ 的機能。

在創藥(yao)(yao)研究(jiu)中，藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的評(ping)價（藥(yao)(yao)物(wu)(wu)動(dong)(dong)態(tai)和(he)毒性(xing)）主要是(shi)通過(guo)動(dong)(dong)物(wu)(wu)實驗進(jin)行的， 然(ran)而(er)(er)從物(wu)(wu)種差(cha)異和(he)愛護動(dong)(dong)物(wu)(wu)的角度出發(fa)，通過(guo)細胞(bao)實驗代替動(dong)(dong)物(wu)(wu)實驗，在“試驗管內(nei)（＝in vitro）”重現(xian)并進(jin)行評(ping)估是(shi)需求所向。由于評(ping)估是(shi)基于人類(lei)來源的腎細胞(bao)而(er)(er)非動(dong)(dong)物(wu)(wu)，除了能消(xiao)除物(wu)(wu)種差(cha)異的問題，細胞(bao)實驗比動(dong)(dong)物(wu)(wu)實驗可(ke)以更快地從研發(fa)初期階段獲(huo)得數(shu)據，從而(er)(er)縮減藥(yao)(yao)物(wu)(wu)研發(fa)時間和(he)成本。然(ran)而(er)(er)，一(yi)直以來都沒有能滿足創藥(yao)(yao)研究(jiu)需求的人腎細胞(bao)。

與活體腎(shen)臟(zang)(zang)相比，傳統的(de)(de)(de)人(ren)腎(shen)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞（HK-2細(xi)(xi)(xi)(xi)胞和初代近端小(xiao)管(guan)上皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞）在(zai)通常的(de)(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)條件下(xia)會喪失(shi)許(xu)多(duo)腎(shen)臟(zang)(zang)特有的(de)(de)(de)機能(Jenkinson et al., Eur J Physiol, 2012) 。因(yin)此(ci)，在(zai)創藥研(yan)究(jiu)時(shi)，很(hen)多(duo)情況下(xia)會通過(guo)動物(wu)實驗對腎(shen)臟(zang)(zang)進行評(ping)估。本次研(yan)究(jiu)中，將在(zai)平面培(pei)(pei)養(yang)(yang)中無(wu)法顯現(xian)的(de)(de)(de)人(ren)近端小(xiao)管(guan)上皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞（RPTEC）的(de)(de)(de)OAT1（有機陰離子轉運蛋白1）的(de)(de)(de)遺(yi)傳基(ji)(ji)因(yin)作為(wei)指標，研(yan)究(jiu)了(le)培(pei)(pei)養(yang)(yang)條件，嘗試改善(shan)了(le)RPTEC的(de)(de)(de)腎(shen)臟(zang)(zang)機能。制造球狀(zhuang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(以下(xia)簡稱3D-RPTEC) ，并(bing)在(zai)?定(ding)條件下(xia)經三(san)(san)維培(pei)(pei)養(yang)(yang)后(hou)，OAT1遺(yi)傳基(ji)(ji)因(yin)顯現(xian)量隨培(pei)(pei)養(yang)(yang)天數(shu)上升，與人(ren)腎(shen)?質的(de)(de)(de)mRNA顯現(xian)量有相同程(cheng)度的(de)(de)(de)改善(shan)（圖1）。對本細(xi)(xi)(xi)(xi)胞實施微陣列的(de)(de)(de)網(wang)羅性遺(yi)傳基(ji)(ji)因(yin)表達解析(xi)和蛋白質組學的(de)(de)(de)網(wang)羅性蛋白質表達解析(xi)的(de)(de)(de)結果(guo)表明，除OAT1外，監管(guan)部門(men)評(ping)估所需的(de)(de)(de)SLC轉運體，比起平面培(pei)(pei)養(yang)(yang)，通過(guo)三(san)(san)維培(pei)(pei)養(yang)(yang)得(de)到了(le)改善(shan)，甚(shen)至在(zai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)32天后(hou)仍(reng)能保持顯現(xian)（圖2）。

此外，在對來自三個(ge)不同供體的(de)(de)RPTEC進行三維培養的(de)(de)mRNA顯現分(fen)析中(zhong)，約17000個(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)中(zhong)有87%的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)僅有50%的(de)(de)CV%變(bian)異(yi)，表(biao)明3D-RPTEC是(shi)一種(zhong)供體差異(yi)小，易于使用的(de)(de)細(xi)胞(bao)。作為(wei)藥物評估的(de)(de)例子，實施了以細(xi)胞(bao)內ATP量（生存率）為(wei)指標的(de)(de)in vitro毒性(xing)(xing)試驗。結果表(biao)明，顯示藥物轉運(yun)體引起腎毒性(xing)(xing)的(de)(de)Cisplatin和Adefovir，濃度依賴性(xing)(xing)地使細(xi)胞(bao)內ATP量減少(shao)。其減少(shao)分(fen)別(bie)被OCT（有機陽(yang)離子轉運(yun)體）的(de)(de)抑制(zhi)劑Cimetidine、OAT（有機陰離子轉運(yun)體）的(de)(de)抑制(zhi)劑Probenecid所(suo)抑制(zhi)（圖(tu)3）。因(yin)(yin)此表(biao)明，3D-RPTEC在醫藥品開(kai)發中(zhong)的(de)(de)藥物動態和毒性(xing)(xing)評估中(zhong)，是(shi)一種(zhong)簡(jian)便且高效的(de)(de)in vitro實驗系列。

概括(kuo)而言，通(tong)過RPTEC制造球狀細胞，在(zai)一(yi)定(ding)條件(jian)下三維培(pei)養的(de)(de)(de)具備腎臟(zang)主要功能之一(yi)的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)轉運(yun)體與人腎臟(zang)的(de)(de)(de)顯(xian)現(xian)(xian)量相(xiang)同，并可長期維持28天以上（專利第6995112號）。另外，3D-RPTEC 還可用(yong)于觀察藥(yao)(yao)(yao)物(wu)轉運(yun)體引起的(de)(de)(de)腎毒(du)(du)性。而且，不僅是(shi)(shi)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)轉運(yun)體，蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學檢(jian)測(ce)到的(de)(de)(de)約4800種(zhong)(zhong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)中(zhong)有(you)90%的(de)(de)(de)顯(xian)現(xian)(xian)量與人腎臟(zang)中(zhong)的(de)(de)(de)顯(xian)現(xian)(xian)量水平(ping)相(xiang)同，這表(biao)明3D-RPTEC在(zai)醫藥(yao)(yao)(yao)品開發中(zhong)的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)動態和毒(du)(du)性評(ping)估(gu)中(zhong)，是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)(zhong)簡便且高效的(de)(de)(de)in vitro實驗系(xi)列(lie)。另外，不僅是(shi)(shi)創藥(yao)(yao)(yao)研(yan)究，這種(zhong)(zhong)人類(lei)腎臟(zang)細胞還有(you)望用(yong)于各(ge)種(zhong)(zhong)與腎臟(zang)有(you)關的(de)(de)(de)研(yan)究中(zhong)。

在3D-RPTEC中(zhong)（左圖(tu)）OAT1遺傳基因的(de)顯現量(liang)隨(sui)著培養(yang)天數的(de)增(zeng)加而增(zeng)加，并在培養(yang)10天后達到最大值(zhi)。

上述(shu)照片(pian)（右圖）由日(ri)機(ji)裝拍攝。

顯示常(chang)規(gui)平(ping)面培養(yang)中RPTEC的(de)遺(yi)傳基(ji)因質顯現量(liang)（A）和3D-RPTEC中的(de)遺(yi)傳基(ji)因顯現量(liang)（B）。與常(chang)規(gui)平(ping)面培養(yang)相(xiang)比，3D-RPTEC中藥物轉運體的(de)顯現量(liang)得到了(le)改善，并(bing)且能夠確定顯現量(liang)從培養(yang)的(de)第12天一直維持到第32天。

顯示了在3D-RPTEC中(zhong)暴露Cisplatin時細胞(bao)內(nei)ATP量（A）與暴露Adefovir時細胞(bao)內(nei)ATP量（B）。使用OCT及OAT的抑制劑，結(jie)果表明3D-RPTEC可檢(jian)測(ce)出藥物轉運體引起的毒(du)性。

根據本研究成果，?機裝株式會社將創藥研究用人腎細胞『3D-RPTEC^?』產品化，于(yu)2023年7月開始正(zheng)式銷售。

今后，將3D-RPTEC作為(wei)腎臟(zang)評估的(de)工具，在實(shi)驗現(xian)場廣泛應用，努力(li)實(shi)現(xian)利用人(ren)腎細(xi)胞進行細(xi)胞實(shi)驗的(de)標準化。